生命科学与工程学院李英研究员团队在大熊猫肠道菌群研究中取得重要进展

发表时间：2023-09-01

2023年8月14日，Microbiome（Top 一区，IF= 15.5）在线发表了题为“The unique gut microbiome of giant pandas involved in protein metabolism contributes to the host’s dietary adaption to bamboo”的学术论文。我校生命科学与工程学院邓飞龙博士为本文的第一作者，我校为第一署名单位，中国国家大熊猫中心王承东、李德生正高级工程师为共同一作，我校李英研究员和美国阿肯色大学赵江潮教授为共同通讯作者。

Deng, F., Wang, C., Li, D. et al. The unique gut microbiome of giant pandas involved in protein metabolism contributes to the host’s dietary adaption to bamboo. Microbiome 11, 180 (2023). 原文链接：

大熊猫是全球野生动物保护的旗舰物种。尽管大熊猫属于食肉目动物，并拥有典型的食肉类动物的胃肠道特征，但其饮食主要由高纤维的竹子组成。大熊猫基因组缺乏消化纤维素和半纤维素所需的酶，因此研究人员普遍认为肠道微生物对大熊猫食性变迁的适应发挥了重要作用。本课题组既往研究发现大熊猫肠道微生物包含少量降解纤维食物/半纤维素的酶，但其含量显著低于典型的草食动物。因此，大熊猫肠道微生物对宿主食性改变的适应性贡献仍然有待深入探究。

本论文通过深度的illumina二代测序和三代测序数据，构建了较为完整的大熊猫肠道微生物基因组（MAGs）；利用宏基因组和宏转录组测序技术，将大熊猫肠道微生物与肉食动物、草食动物和杂食动物的消化道微生物进行比较，发现大熊猫肠道微生物的氨基酸代谢显著区分于草食动物；进一步分析发现非解乳糖链球菌(Streptococcus alactolyticus)可能是大熊猫肠道微生物氨基酸代谢的关键微生物，小鼠灌胃实验证明非解乳糖链球菌显著提高小鼠空肠内容物中必需氨基酸水平。

图1. 实验设计概述示意图

结果解读

1、大熊猫肠道微生物宏基因组组装基因组（MAGs）构建

尽可能完整的重构肠道微生物基因组对于研究肠道微生物功能，尤其是独特的微生物和功能至关重要。本论文结合6.3T Illumina 二代宏基因组测序数据和0.3T Nanopore三代宏基因组数据，构建出610个中高质量的微生物基因组，非冗余基因组408个，高质量基因组148个，平均覆盖76.47%的宏基因组reads。主要以厚壁菌门 (204 MAGs, 50.00%) 、变形菌门 (139 MAGs, 34.07%), 拟杆菌门 (33 MAGs, 8.09%) and 和放线菌门(21 MAGs, 5.15%)为主。

图2. 408个宏基因组组装基因组(MAGs)的分类注释和系统发育树

2. 大熊猫肠道微生物宏转录组分析

既往研究基于宏转录组测序技术解析大熊猫肠道微生物功能，但是对微生物的表达情况知之甚少。论文利用14个圈养大熊猫粪便样本，结合宏基因组和宏转录组数据分析了大熊猫肠道微生物的表达活跃度。

在种水平，宏基因组数据显示的大熊猫肠道微生物的优势种为E. flexneri，平均相对丰度为27.10%，其次是S. alactolyticus（24.34%）和E. coli（6.08%）。然而，通过宏转录组数据分析发现表达丰度最高的物种是S. alactolyticus，平均丰度为45.45%，其次是E. flexneri（10.49%）和Leuconostoc lactis A（3.66%）。值得注意的是，尽管根据宏基因组数据，E. coli是第3丰富的物种，但根据宏转录组数据，其平均丰度只有2.38%，排名第六。

图3. 基于宏基因组和宏转录组的相对丰度（表达量）Top10物种

3、宏转录组数据分析为大熊猫营养代谢基因表达概况提供了新的见解

课题研究了主要营养物（例如，碳水化合物，氨基酸）代谢中的微生物代谢途径，并基于宏基因组丰度和宏转录组表达与草食性（牛和羊）、杂食性（猪，老鼠和人）和肉食性（猫）进行了比较。对27个纤维/半纤维/木质素降解相关的基因家族的相对丰度和表达丰度比较，发现大熊猫中涉及植物细胞壁降解的微生物基因家族的代谢途径与猫的更为相似。肉食动物肠道中这些基因家族的相对丰度与草食动物（ANOSIM，R=0.81，P=0.001）和杂食动物（ANOSIM，R=0.93，P=0.001）（图4A）显著不同。而基于宏转录组数据的分析，也显示出类似的模式，即肉食动物显著地与杂食动物（ANOSIM，R=0.37，P=0.001）和草食动物（ANOSIM，R=0.75，P=0.001）分离（图4B）。包括endo-1,4-beta-xylanase (EC ), cellobiose phosphorylase (EC ), and endo-cellulase (EC ) 等关键酶在内都与肉食动物猫相似，低于草食动物和杂食动物，这表明大熊猫的肠道微生物不具备帮助宿主利用竹子纤维获得额外能量的潜能。

图4. 不同宿主种类肠道微生物组中膳食纤维代谢酶相关基因的组成与表达模式

既往研究表明，竹子中的蛋白质可能是大熊猫的主要能量来源。因此，本课题分析了涉及氨基酸代谢的基因家族的丰度和表达，包括61个编码氨基酸降解酶的基因家族和98个涉及氨基酸合成的基因家族。基于宏基因组数据中的基因丰度的Beta多样性（Bray-Curtis）显示，不同的宿主物种在涉及氨基酸降解的基因上有显著的差异（ANOSIM，P≤0.05）（图5A）。肉食动物（大熊猫和猫）与杂食动物（R=0.616，P=0.001）和草食动物（R=0.576，P=0.001）差异显著，而杂食动物和草食动物差异显著但R值较低（R=0.203，P=0.002）。在氨基酸生物合成方面，基于宏基因组（图5C）和宏转录组（图5D）数据集的PCoA图上，大熊猫与其他宿主物种显著不同（P<0.01）。

图5. 不同宿主物种肠道微生物组中涉及氨基酸代谢的基因的丰度和表达模式

4. 大熊猫肠道微生物的必需氨基酸合成

植物蛋白往往缺乏某些动物所需的必需氨基酸，为了探索肠道微生物是否帮助宿主合成必需氨基酸，本研究分析了 S. alactolyticus（大熊猫肠道中表达活跃度最高的微生物）中涉及必需氨基酸生物合成的基因的丰度。根据S. alactolyticus的相对丰度（RA）对圈养大熊猫重新分组为三组：高丰度组[RA ≥ 50%，n = 28]，中丰度组(50% > RA ≥ 25%，n = 29)和低丰度组(RA < 25%，n = 33)，比较分析显示，高丰度组的map00300 KEGG途径(图6A)和map00400 KEGG途径(图6B)的丰度显著高于中等(map00300: P = 0.027, map00400: P = 0.0056)和低丰度组(map00300: P = 0.0049, map00400: P = 0.0014)组。对于map00290 KEGG途径(图6C)，其在高组的丰度显著高于中等组(P = 0.040)，高丰度组与低丰度组之间差异不显著。结果显示S. alactolyticus可能对大熊猫氨基酸合成有重要的贡献。

图6. 在不同S. alactolyticus相对丰度必需氨基酸生物合成的KEGG途径的相对丰度差异

为了验证非解乳糖链球菌（S. alactolyticus）在肠道中合成必需氨基酸的作用，首先从大熊猫中分离出S. alactolyticus，然后灌胃给低蛋白和正常蛋白日粮的BALB/c小鼠。灌胃结束后3周取空肠内容测定代谢组。结果表明，对于低蛋白饮食的小鼠，灌胃组的非必需氨基酸（8.64 × 10¹⁰ vs. 9.89 × 10¹⁰, P = 0.034）和必需氨基酸（3.71 × 10¹⁰ vs. 4.83 × 10¹⁰, P = 0.042）的总丰度均显著高对照组。而正常日粮下，灌胃组的非必需氨基酸（8.01 × 10¹⁰  vs. 8.72 × 10¹⁰, P = 0.21）和必需氨基酸（3.37 × 10¹⁰ vs. 3.99 × 10¹⁰, P = 0.087）丰度更高，但没有统计学意义。对于特定的氨基酸种类，在低蛋白日粮下，缬氨酸（P = 0.039）和酪氨酸（P = 0.027）在灌胃组中的丰度显著更高；而当给予正常蛋白饮食时，谷氨酸（P = 0.033）在灌胃组中显著增加。

图7. 不同处理组小鼠氨基酸丰度比较

本研究重建了总共408个非冗余的宏基因组组装基因组（MAG），发现大熊猫的肠道微生物群在蛋白质代谢而非碳水化合物代谢中起到了重要作用。进一步证明非解乳糖链球菌（S. alactolyticus）作为大熊猫肠道微生物最丰富的细菌种类，参与了大熊猫肠道的蛋白质代谢。本项研究为提高我们对大熊猫肠道微生物多样性和代谢潜力的认识提供了基础，从微生物氨基酸代谢的角度解释大熊猫肠道微生物对大熊猫食性转变的作用，为我们解析大熊猫的适应性进化提供了一个新的视角。李英课题组近10年以来，对大熊猫肠道菌群的组成、潜在功能、对宿主适应竹子的作用及其在大熊猫野化训练及迁地保护中的潜在影响进行了较为系统的研究，成果在Molecular Ecology，Frontiers in Microbiology等期刊发表SCI论文10余篇。

（生命科学与工程学院）